Advanced Science

杜亚楠团队开发出一种基于疤痕降解型内皮细胞的晚期肝纤维化治疗方法

慢性肝损伤会发展为肝纤维化，进一步发展为肝硬化。目前，肝脏移植是肝硬化的唯一有效临床治疗手段。因此，研究针对肝纤维化，特别是晚期肝纤维化的治疗策略至关重要。在肝纤维化发展过程中，大量细胞外基质（ECM）因为生成和降解失衡而过量沉积于肝脏中，最终导致肝组织纤维化和硬化。其中，胶原蛋白，特别是Ⅰ型胶原蛋白是ECM的主要成分，也在纤维化肝脏中大量沉积。因此靶向干预纤维化组织中沉积的胶原，为晚期肝纤维化和肝硬化治疗提供了潜在思路。

基质金属蛋白酶（MMP）是体内降解胶原蛋白的主要的酶，而金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）可以在体内抑制MMP的活性。MMP与TIMP的失衡与肝纤维化中ECM的积累相关。MMP可由多种类型的细胞分泌，如内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和中性粒细胞。通过细胞分泌MMP来降解沉积的ECM，可能有助于晚期肝纤维化的治疗。

近日，清华大学医学院杜亚楠实验室在Advanced Science杂志上发表了题为Scar-Degrading Endothelial Cells as a Treatment for Advanced Liver Fibrosis的文章。该研究经过高通量筛选发现内皮细胞在特定组合因子的刺激下，可以分泌大量MMP，并在体外有着显著的降解ECM的能力。这种瘢痕降解型内皮细胞在四氯化碳诱导的晚期肝纤维化小鼠上也表现出了一定的治疗效果，提供了一种基于内皮细胞的ECM降解能力的晚期肝纤维化治疗策略。

该研究首先构建了一个高通量平台来精确量化细胞的胶原蛋白降解能力（CEDSS），将细胞与标记了荧光分子的胶原蛋白共培养，通过检测上清中荧光信号强度来定量细胞的降解能力。接着，该研究在筛选了多种类型的细胞和因子后，发现肝窦内皮细胞（LSEC）在被PMA和Accutase处理后，表现出卓越的降解胶原的能力（这种处理后的LSEC记为dLSEC，未处理的记为nLSEC）。这种降解能力通过CEDSS和胶原蛋白杂交肽（CHP）两种方法进一步验证。

图1. CEDSS的构建和具有强ECM降解能力的dLSEC的筛选

接着，作者进一步探究了dLSEC的降解能力。作者发现dLSEC在撤去刺激后仍然具有ECM降解能力，且随着时间的推移逐渐降解共培养的胶原蛋白。扫描电子显微镜（SEM）成像显示出了dLSEC与胶原蛋白的相互作用。另外，dLSEC还可以降解晚期肝纤维化小鼠的脱细胞化基质。作者将dLSEC与晚期肝纤维化小鼠的脱细胞化基质通过transwell共培养，发现dLSEC可以显著降解此脱细胞化基质。

图2. dLSEC在体外表现出ECM降解能力

为了确定dLSEC降解ECM的机制，作者通过RNAseq分析了dLSEC与nLSEC的基因表达差异。结果显示，MMP1、3、9、10、13、14和TIMP1在dLSEC中均上调，同时TIMP2和TIMP4下调。多种MMP的上调同样通过qPCR、MMP array和 Secretomics得到验证。另外，在用MMP抑制剂GM6001处理dLSEC后，dLSEC的ECM降解能力被显著抑制。这些结果均说明dLSEC是通过大量分泌MMP来发挥降解ECM的功能。

为了进一步探究dLSEC降解ECM的关键因子，作者通过RNAseq的数据分析锁定了转录因子c-fos。作者发现，LSEC在受到PMA和Accutase刺激后，c-fos在基因水平和蛋白水平出现瞬时上调，并且在刺激后出现c-fos转运入核的现象。另外，在用c-fos抑制剂T5224处理dLSEC后，MMP9的表达水平和dLSEC的降解能力均受到显著抑制。

为了验证dLSEC对晚期肝纤维化的治疗效果，作者先将dLSEC经脾注射至四氯化碳诱导15周的小鼠中，并通过天狼星红染色、胶原免疫荧光染色、原位明胶酶谱法、羟脯氨酸定量等方式表征了dLSEC的治疗效果。另外，dLSEC还在体外表现出使人肝星状细胞LX2静息的效果。体内经脾注射后，αSMA阳性细胞减少，这说明除了降解沉积的ECM，dLSEC还可能通过使肝星状细胞静息的方式促进晚期肝纤维化恢复。除了经脾单次注射，作者还通过腹腔多次注射表面修饰fpp（TGase介导的靶向肝损伤区域的肽）的dLSEC，同样表现出治疗晚期肝纤维化的效果。

为了满足临床治疗的需求，作者想用已有临床研究的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）代替LSEC。通过CEDSS筛选，作者发现HUVEC在受到PMA和TNFα处理后表现出显著的降解能力（记为dHUVEC）。作者在体外表征了dHUVEC的降解能力后，经脾注射单次dHUVEC在四氯化碳诱导的晚期肝纤维化小鼠中表现出良好的治疗效果。另外，作者将dHUVEC与肝硬化患者的肝组织或人去细胞化肝硬化组织样本共孵育，结果发现dHUVEC在这些组织或去细胞化基质上也展现出显著的降解能力，进一步说明了这种瘢痕降解型内皮细胞疗法具有推广至临床的潜力。

图3. dHUVEC在晚期肝纤维化小鼠的治疗效果和降解人肝硬化组织样本

总之，该研究在体外构建了ECM降解筛选系统（CEDSS），基于此筛选系统发现了内皮细胞在受到特定组合因子刺激后，会表现出显著的降解能力。这种瘢痕降解型内皮细胞不仅在体外具有降解ECM的能力，还在四氯化碳诱导的小鼠晚期肝纤维化模型上促进了晚期肝纤维化的恢复，提供了一种基于ECM降解的肝纤维化细胞疗法。

清华大学医学院生物医学工程系、清华-北大生命科学联合中心杜亚楠教授为该论文通讯作者。清华大学医学院博士生赵鹏为本文第一作者。清华大学医学院博士生孙天、吕丞、牛宇迪、张钰莹，硕士生梁恺倪以及清华大学附属北京清华长庚医院主任医师项灿宏亦对本研究做出重要贡献。

原文链接：

DOI:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/term.3341

       NBME News DOI:https://doi.org/10.1038/s41551-023-01119-w

       AS Comments DOI: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202207396