清华&中检院&华龛合作在线发表-单批次百亿干细胞生产方案【基于GMP级3D微载体的自动化封闭式工业级干细胞“智”造工艺】

近日，清华大学医学院杜亚楠教授团队联合中国食品药品检定研究院孟淑芳主任团队、南京鼓楼医院王斌主任团队以及北京华龛生物科技有限公司、北京贝来生物科技有限公司共同在Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine（《组织工程和再生医学杂志》），发表了题为“GMP‐grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs（基于GMP级3D微载体的自动化封闭式工业级干细胞生产平台）”的研究论文。

研究发现：基于GMP级3D微载体的3D FloTrix®工艺（包含逐级放大的生物反应器和细胞自动化收获装置）可实现自动化封闭式工业级干细胞生产，细胞放大培养13天即可达到百亿数量，使用3D FloTrix®vivaPREP自动化细胞收获装置单批次获得200亿以上细胞并形成制剂。整个生产工艺采用全封闭自动化流程，实时检测细胞数量和质量，最终细胞制剂执行严格的质检建库标准，成功实现高质量工业级干细胞制剂生产。

1. 研究背景

研究发间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cell, MSC）产业化扩增是当前细胞治疗和再生医学临床应用的巨大挑战之一。当前MSC产业化生产工艺主要使用细胞工厂进行二维（two dimensional, 2D）平面培养（图1），该生产工艺依赖于人工，因此会导致人力成本高，易污染，生产过程无法实时检测细胞质量，单批次产量低，批次间产品稳定性差等问题。

图1. 传统干细胞生产工艺和其局限性

为克服2D培养的缺点，助力干细胞治疗的产业化发展，清华大学杜亚楠课题组联合中国食品药品检定研究院孟淑芳主任、南京鼓楼医院王斌主任联合打造基于GMP级3D微载体的自动化封闭式工业级干细胞“智造”平台（automated closed industrial scale cell production，ACISCP）。该平台使用三级3D FloTrix®vivaSPIN生物反应器在13天完成工业化级别细胞扩增，使用3D FloTrix®vivaPREP自动化细胞收获装置单批次获得200亿以上细胞制剂。ACISCP生产工艺采用全封闭自动化流程，实时检测细胞数量和质量，最终细胞制剂执行严格的质检建库标准，成功实现高质量工业级别干细胞制剂生产（图2），助力细胞治疗行业快速发展。

图2. 自动化封闭式工业级干细胞生产示意图

2. 研究内容

3D TableTrix®微载片是由100-200μm微载体制成的片剂（图3-A），遇水即散。电镜图片显示3D微载体具有多孔结构，间充质干细胞可以贴附于载体内部（图3-B），处于三维环境中生长。细胞收获可以通过特制的微载体裂解液3D FloTrix Digest®降解微载体（图3-C），细胞释放后实现无损收获。文中使用3D TableTrix®微载体实现脐带间充质干细胞（UCMSC）、脂肪间充质干细胞（ADMSC）和牙髓间充质干细胞（DPSC）高效扩增（图3-D）。

图3. GMP级别3D TableTrix® 微载体特征

ACISCP平台包含3D FloTrix® vivaSPIN 1L、5L、15L生物反应器和3D FloTrix®vivaPREP分别用于细胞的扩增和收获（图4-A）。生物反应器可节约空间，例如使用3D TableTrix®微载体结合5L生物反应器占用0.494m2的面积，可提供9m2细胞培养面积（图4-B）。细胞在各级生物反应器中可实现良好的贴附和增殖（图4-C），经过逐级放大最终收获2.09×1010细胞，完成1975倍增殖（图4-D，4-E）。

图4. 自动化封闭式平台实现工业级别MSC扩增

使用ACISCP平台进行生产的每个阶段均有相应质检指标，在最终制剂阶段将对细胞制剂进行全面检验，包括无菌性、安全性、纯度、活力、干性特征、稳定性和治疗潜能等7个方面（图5-A），检测指标均合格。值得注意的是，在使用微载体三维培养过程中微载体残留和裂解液残留检测均远远低于合格线。该部分数据说明使用ACISCP平台生产细胞制剂安全合格（图5-B）。

图5. ACISCP平台生产过程中质检指标

干细胞治疗潜能是未来临床是否成功的关键之一。干细胞通过分泌多种因子或外泌体调节免疫反应、血管生产和细胞增殖功能。本文比较2D和3D细胞上清中多种因子分泌（图6-A, 6-B）。用ELISA检测VEGF分泌显示3D培养细胞分泌VEGF量明显大于2D。另外检测3D培养细胞免疫活性，显示3D扩增细胞可以促进外周血单个核细胞（PBMC）向Treg分化（图6-C），抑制向TH1和TH17方向分化（图6-D, 6-E）。这部分结果说明3D培养细胞具有更强的分泌能力，并保持MSC调节免疫的功能。

图6. ACISCP平台收获3D MSC治疗潜能

3. 研究结论

以上研究建立了一条全新的自动化封闭式产业级别干细胞制造平台ACISCP，满足细胞治疗产业对于细胞数量和质量的需求，同时大大降低人工成本、时间成本和仪器耗材等成本。ACISCP平台与其相对应的质检标准将加速干细胞治疗产业化发展，推动细胞治疗早日造福人类健康。

4. 研究团队

本项目由清华大学、中国食品药品检定研究院、南京鼓楼医院、北京华龛生物科技有限公司以及北京贝来生物科技有限公司合作完成。

清华大学杜亚楠教授、中国食品药品检定研究院孟淑芳主任、南京鼓楼医院王斌主任为本论文通讯作者。

北京华龛生物科技有限公司张元元博士、中国食品药品检定研究院纳涛副研究员和张可华副研究员为本论文的共同第一作者。

5. 研究应用材料及设备

原文链接：

DOI:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/term.3341